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밤마다 모든 것이 살아나는 뉴욕 자연사 박물관. 야간 경비원 ‘래리’(벤 스틸러)는 대통령 ‘테디 루즈벨트’(로빈 윌리엄스), 카우보이 ‘제레다야’(오웬 윌슨), 말썽꾸러기 원숭이 ‘덱스터’ 등 매일 밤 살아나는 전시물들과 함께 판타스틱한 박물관 재개장 전야 이벤트를 개최한다. 하지만 점차 마법의 기운을 잃어 가는 황금석판으로 인해 다시는 살아나지 못할 위기에 처한 그들은 황금석판의 비밀을 밝혀내기 위해 영국 런던 대영박물관으로 향하는데...